روشهای بیوشیمی مطالعة سلول
| دسته بندی | شیمی |
| بازدید ها | 0 |
| فرمت فایل | doc |
| حجم فایل | 2010 کیلو بایت |
| تعداد صفحات فایل | 66 |
روشهای بیوشیمی مطالعة سلول
سیتوشیمی
با کمک روشهای سیتوشیمی می‌توان ساختمانهای شیمیایی اجزاء سلول را در وضعیت طبیعی ( In Situ ) آن شناخت دو راه را برای این منظور وجود دارد :
1) استفاده از مواد شیمیایی که در اثر تماس با مواد دیگر درون سلول واکنشی ظاهر سازند که به کمک میکروسکوپ الکترونی قابل رؤیت است .
برای مطالعة با میکروسکوپ نوری بایستی این مواد شیمیایی رنگی باشند و برای مشاهده در میکروسکوپ الکترونی باید این مواد مانع حرکت الکترونها، یا باعث پراکندگی آنها گردند. (1)
2 ) امکان دوم استفاده از آنزیم‌هایی است که بطور اختصاصی موادی را تجزیه نمایند این مواد بعداً در سلول قابل رؤیت نیستند تعیین اینکه محصول یک واکنش جزئی از ساختمان سلول است یا خیر زمانی ممکن است که نتیجه واکنش سبب انباشتگی و تراکم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر این واکنش باید طوری اختصاصی باشد که قضاوت قابل اعتمادی را ممکن سازد از طرف دیگر اجزاء سلولی به قدر کفایت طبیعی باقی بمانند تا مقایسه و قضاوت را ممکن سازند (مثلاً تراکم موادی در میتوکندری زمانی قابل اثبات است که ساختمان میتوکندری به شکل طبیعی آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن می‌گردد :
در نقاط مختلف سلول فسفاتاز یعنی آنزیمی که هیدرولیز فسفات را تسریع می‌نماید وجود دارد اگر یک سلول ثابت شده با آلدئید را (آلدئید فعالیت آنزیمی را از بین نمی‌برد) با مخلوطی از فسفات محلول و نیترات سرب مجاور کنیم (قطره‌ای روی بافت قرار می‌گیرد) در نقاطی که آنزیم موجود است فسفات هیدرولیز شده و تولید اسید فسفریک می‌نماید که خود در اثر ترکیب با نیترات سرب فسفات سرب به وجود می‌آورد .
این ترکیب غیر قابل حل در آب بوده و تولید رسوبی می‌نماید که به شدت الکترونها را متفرق می‌کند به این ترتیب تمام نقاطی که دارای فسفاتاز هستند در سلول مشخص می‌گردند .
دیواره غالب سلولهای گیاهی دارای سلولز می‌باشد که با املاح فلزات سنگین کنتر است ندارد اگر آنزیم سلولاز را روی سلول ثابت شده با آلدئید اثر دهیم سلولز به موادی که ملکولهای ریز قابل حل در آب تبدیل می‌گردند این عمل منجر به از بین رفتن کنتر است تقاطعی که قبلاً سلولز وجود داشت می‌گردد با این روش می‌توان پی به مقدار کمی سلولز در دیواره سلولزی و احتمالاً چگونگی سنتز آن پی برد . (2)
اتورادیوگرافی ( AUTORADIOGRDHY ) :
ایزوتوپهای رادیواکتیو ایزوتوپهایی هستند که هسته آنها در اثر تشعشع پیوسته تحلیل می‌رود این گونه ایزوتوپها در سیتولوژی برای ردیابی مواد معینی در سلول به کار گرفته میشود با کمک منوساکاریدهای علامت‌گذاری شده با14 Cمی‌توان بوسیله روشهای اتورادیوگرافی یا به طور مستقیم توسط اندازه‌گیری فعالیت تشعشعی اجزاء مختلف سلول سنتز پلی‌ساکاریدها را مشخص کرد روش اخیر با کمک دستگاه مخصوصی به نام سین‌سیلاسیون شمار (نور ساطع کردن و برق زدن = Scintilation ) انجام می‌گیرد .
در روش مستقیم اتورادیوگرافی می‌توان از میکروسکوپ نوری یا الکترونی استفاده کرد در هر دو مورد بافت بعد از دریافت ماده رادیو اکتیو ( خوراندن ـ تزریق ) ثابت آغشته و برش داده میشود مقاطع بعداً با لایه‌ای حساس یا فیلم پوشانده می‌شوند تشعشعات ماده رادیو اکتیو مثل اشعه نور صفحه فیلم یا ماده حساس دیگر را متأثر و فیلم پس از ظهور در محل سیاه شده مورد مطالعه قرار می‌گیرند شرط موفقیت دراتورادیوگرافی انتخاب ماده حساس برای پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقیق برای تأثیر اشعه و بالاخره ظاهر کردن مناسب ماده حساس یا فیلم می‌باشد معذالک نمی‌توان از این روش در هر موردی از سیتولوژی استفاده نمود اتورادیوگرافی بیش از هر روش دیگر به دقت و تجربه نیازمند است . (2)
جداسازی اجزاء سلول :
برای انجام آزمایشات شیمی با اندازه‌گیری و مطالعه عمل اجزاء مختلفه یک سلول : لازم است که این اجزاء از بقیه قسمتها جدا گردند برای این منظور سلولها هموژن می‌شوند بعد محتویات سلولها با کمک اولترا سانتریفوژ به صورت بخشهای مستقلی که هر یک محتوی ساختمان خاصی از سلول هستند از هم جدا می‌گردند .
عمل هموژن کردن در سلولهائی که با دیواره سختی پوشیده نمی‌شوند از طریق شوک اسمزی با تأثیر امواج صوتی بالای Hkz 20 صورت می‌گیرد .
سلولهای بادیواره سخت بایستی در هموژنیزاتور با چاقو یا گلوله‌های شیشه‌ای ذرات کوارتز و نظایر آن ساییده شوند در هر حال این عمل نباید موجب آسیب و در نتیجه کاهش فعالیت اجزاء سلولهای گردد عمل سانتریفوژ کردن در دو مرحله انجام می‌گیرد :
1 ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION
2 )جدا کردن به طریق هموژنی ( ISOPICNIC )
کروماتوگرافی ( CHROMATOGRAPHY ) :
با کمک روشهای کروماتوگرافی ملکولهای مختلف بر اساس ویژگیهای متفاوت خود نظیر ملکولها ( فیلترژله‌ای ) حلالیت در دو فاز ( کروماتوگرافی تقسیمی ) و بالاخره خصوصیات جذبی ( کروماتوگرافی جذبی ) از یکدیگر جدا می‌گردند . (3)
الکتروفورز ( ELECTROPHORESIS ) :
ملکولهای دارای بارالکتریکی نظیر اسیدهای آمینه و پروتئینها در یک میدان الکتریکی توجه به نقطه ایزوالکتریک خود با سرعتهای متفاوت مهاجرت می‌نماید این کیفیت را الکتروفورز می‌گویند پس در این روش ملکولهای دارای بار الکتریکی بر حسب سرعت خود مشخص از یکدیگر جدا می‌گردند عمل الکتروفورز می‌تواند در یک محلول بافر انجام می‌گیرد غالباً برای محلول بافر که نقش الکترولیت را دارند ناقل سختی نظیر کاغذ لایه‌های نازک استات یازل پلی‌آکریل آمید ( Polyacrylamidgl ) انتخاب می‌گردد در اینجا ملکولها نه تنها به علت بار الکتریکی متفاوتشان بلکه بر حسب اندازه و شکل ملکول‌هایشان جدا می‌گردند هرچه وزن ملکولی بیشتر باشد حرکت ملکول کندتر است ساختمان فضائی ملکولها نیز در حرکتشان مؤثر است .
اساس کار به قرار زیر است :
ژل جدا کننده با ژل یک ثانویه باروزنه‌های درشت پوشیده میشود که روی آن محلول مورد آزمایش منتقل می‌گردد در میدان الکتریکی ملکولها در ژل ثانویه مهاجرت می‌نمایند و در مرز بین دو ژل در یک بخش نازک متمرکز می‌شوند در اینجا ملکولها در ژل جدا کننده ( اولیه ) بر طبق اندازه ملکولها و تحرک الکتروفورزی خود جدا می‌گردند بین ژل جدا کننده ( اولیه ) و ژل جمع کننده ( ثانویه )، دو عامل غیر هماهنگ PH و اندازه روزنه‌ها در دو ژل موجود می باشند . (3)
فتومتری ( PHOTOMETRIE ) :
عده‌ای از اجزاء سلولی این خاصیت را دارند که امواج نوری با طول موجهای معین را جذب نمایند و با این کیفیت می‌توان این اجزاء را از نظر کیفی و کمی مورد مطالعه قرار داد . (3)
متد کشت سلول :
تکنیک کشت سلول یا بافت در بیوشیمی بیولوژی ملکولی فیزیولوژی سلولی ژنتیک، جنین شناسی، انگل شناسی، بافت شناسی و غیره به کار می‌رود معمولی‌ترین سلولهایی که کشت داده می‌شوند سلولهای باکتریها و سلولهای بافتهای پستانداران هستند برای کشت سلول باید اول محیط کشت مناسب آن نوع سلول خاص تهیه گردد که در آن عوامل منبع انرژی سلولها، امواج، عوامل رشد، اسیدیته ( PH ) مناسب و حرارت مورد توجه قرار می‌گیرند .
محیط کشت سلولهای پستانداران پیچیده‌تر از محیط کشت مورد نیاز سلولهائی نظیر باکتریهاست در ابتدای کار کشت سلول این‌طور معمول بود که مخلوطی از سرم و عصارة جنین جوجه، به عنوان محیط کشت بکار برده می‌شدند در سلولهای اخیر محیط کشت ترکیبی درست شده که محتوی ترکیبات متعددی است بعنوان مثال می‌توان محیط کشت ترکیبی از آب، املاح و مواد معدنی و محتوی متابولیتهای زیادی باشد حتی امروزه علیرغم ترکیبات پیچیده محیطهای کشت ترکیبی به طور معمول لازم است که از سرم جنین یا سرم اسب و غیره بعنوان تکمیل کننده محیط کشت که باعث رشد سلول شود استفاده نمایند ساده‌ترین تکنیک برای مطالعه رشد سلولهای پرندگان و پستانداران متد برداشت بافت است قطعه کوچکی از بافت را روی لاملی که با قطره‌ای از پلاسمای جوجه و محیط کشت پوشیده است قرار می‌دهند پلاسما سخت شده و منعقد می‌گردد لامل بر روی یک لام گرد برگدانده میشود به طوریکه بافت و پلاسما در سطح زیرین قرار گیرند اطراف لامل توسط پارافین مذاب با قلم‌مو کاملاً مسدود و کشت در محیط با حرارت مناسب نگهداری میشود .